La técnica de ddPCR se basa en la partición de muestras de ácido nucleico en decenas de miles de microgotas de volumen definido en una emulsión de agua y aceite. La amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos diana se lleva a cabo dentro de cada microgota utilizando un flujo de trabajo y reactivos similares a los utilizados en un ensayo estándar basado en sondas TaqMan®. Según la detección de fluorescencia después de la amplificación, cada microgota se cuenta y se califica como PCR-positiva o PCR-negativa. La concentración objetivo de la plantilla de ADN/ARN (copias/μl) en la muestra original se cuantifica utilizando una distribución de Poisson.1,2
La ddPCR puede medir cantidades absolutas de secuencias de ácidos nucleicos por volumen de muestra sin extrapolaciones de curvas estándar o estándares de referencia. Puede detectar pequeños cambios en volúmenes de muestra muy bajos que pueden no detectarse mediante qPCR. Los resultados de ddPCR son más exactos, sensibles y precisos que los resultados de qPCR debido a los miles de puntos de datos para cada muestra.
La ddPCR puede detectar cualquier tipo de secuencias de ADN o ARN para las que se puedan construir cebadores y sondas, como ctDNA, cfDNA/ARN, mRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, miRNA o siRNA.
En ddPCR se puede utilizar cualquier muestra que contenga secuencias de ADN o ARN, como lisados celulares y tisulares, tejidos, fluidos biológicos (sangre, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, orina, saliva, etc.), sobrenadantes celulares o productos de ácidos nucleicos sintéticos.
Al igual que la qPCR, una ejecución típica dura unas cuatro horas. El flujo de trabajo de ddPCR requiere un paso adicional para crear las decenas de miles de microgotas de aceite de tamaño nanolitro. Sin embargo, el tiempo adicional para este paso se ve anulado por el análisis digital simplificado del lector de ddPCR.
Las muestras que consisten en ADN/ARN extraído/aislado/purificado se pueden correr y analizar con el Bio-Rad QX200 ddPCR System de inmediato. Los sobrenadantes celulares y los lisados celulares/tisulares requerirán extracción/aislamiento/purificación de ADN o ARN antes de que se pueda realizar el ensayo ddPCR. Para garantizar la seguridad del personal del laboratorio de Labcorp, los tejidos, los fluidos biológicos y los sobrenadantes celulares requerirán pruebas obligatorias de patógenos antes de su manipulación en los laboratorios de Labcorp. Además, todos los materiales de origen humano (tejidos o fluidos corporales), microorganismos o virus, productos creados en sistemas biológicos con contaminación potencial por riesgo biológico y moléculas de ácido nucleico recombinantes y/o sintéticas requieren la cumplimentación de un Formulario de Registro de Bioseguridad y la posterior aprobación por parte del Comité de Bioseguridad de Labcorp PCO antes de la manipulación de los materiales.
Si no está extrayendo/aislando/purificando el ADN/ARN antes de enviar las muestras para ddPCR, Labcorp PCO recomienda proteger/estabilizar/preservar los ácidos nucleicos en muestras de células y tejidos con una solución de preservación de ácido nucleico (como RNAlater®, DNA/RNA ShieldTM o RNAprotect®) antes de congelarlas y enviarlas.
Todas las muestras deben enviarse congeladas en una caja aislada con hielo seco.
1. Sistema de PCR digital de gota QX200. BIO-RAD. https://www.bio-rad.com/en-us/life-science/digital-pcr/qx200-droplet-digital-pcr-system.
2. Taylor SC, Laperriere G, Germain H. PCR digital de gotas versus qPCR para el análisis de expresión génica con objetivos poco abundantes: desde datos variables sin sentido hasta datos de calidad de publicación. Sci Rep. 2017;7:2409. doi:10.1038/s41598-017-02217-x.
