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Interacciones farmacológicas y transportadores

Los transportadores de fármacos de membrana, ubicados en muchos tejidos de barrera del cuerpo, pueden interactuar con los fármacos para afectar la absorción, distribución y eliminación in vivo, y son la causa de interacciones farmacológicas (DDI) clínicamente relevantes. La identificación del artículo de ensayo como sustrato o inhibidor de los transportadores puede explicar las exposiciones alteradas y las toxicidades clínicamente relevantes de los fármacos administrados concomitantemente. La permeabilidad intestinal de un fármaco es un factor importante que impulsa la fracción absorbida y puede evaluarse mediante el ensayo de transporte monocapa de Caco-2.

Consideraciones reglamentarias para las interacciones con los transportadores

Estos estudios son recomendados por las pautas de interacción farmacológica (DDI) de la FDA y la EMA para evaluar las interacciones del transportador antes de realizar los primeros ensayos en humanos. Los estudios de transportadores destacan problemas potenciales para lograr concentraciones plasmáticas eficaces de medicamentos administrados concomitantemente debido al impacto de un medicamento en la absorción o distribución.

Varios transportadores interactúan con medicamentos en uso clínico. Los recomendados para la prueba incluyen:

  • Transportadores de eflujo de casete de unión a ATP (ABC), P-glicoproteína (P-gp), proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y bomba de exportación de sales biliares (BSEP).
  • Transportadores de captación de portadores de solutos (SLC), transportador de aniones orgánicos (OAT) 1 y OAT3, transportador de cationes orgánicos (OCT) 2, polipéptido transportador de aniones orgánicos (OATP) 1B1, OATP1B3 y transportadores de extrusión de fármacos y toxinas múltiples (MATE) 1 y MATE2 K.

Métodos para las interacciones del transportador

  • Sistema de prueba: Líneas celulares transfectadas que expresan un transportador de captación única (SLC) o control vectorial, cultivadas en monocapas en una incubadora humidificada a 37°C en 5% de CO2.
  • Tampón de ensayo: HBSS con HEPES, pH 7.4
  • Solo para los transportadores de MATE, las células se tratan previamente con NH4Cl para introducir un gradiente de pH a través de la membrana celular, necesario para la actividad de absorción de MATE
  • Concentraciones de compuestos de prueba: 2 para ensayos de sustrato, 2 para ensayos de inhibición
  • Sustratos de sonda radiomarcados específicos para cada transportador
  • Inhibidores de control positivo para cada transportador

Las células que expresan transportadores en cultivo se preincuban con un tampón de ensayo durante 30 minutos en una incubadora humidificada a 37°C en 5% de CO2. Las células que expresan MATE se tratan con NH4CI para crear un gradiente de pH a través de la membrana celular para facilitar la actividad de absorción. Se agrega un sustrato de sonda o un artículo de prueba en pocillos por triplicado y se agregan inhibidores cuando corresponde. Las placas se incuban durante un punto de tiempo de 2 a 10 minutos, dependiendo del transportador. Se aspira el tampón y las células se lavan, luego se lisan, recolectan y analizan para detectar la presencia del artículo de prueba utilizando LC-MS.

Evaluación del sustrato: La absorción del artículo de prueba por cada transportador solamente o en presencia de un inhibidor selectivo se comparará con la absorción por el control vectorial tras una incubación de 2 a 5 minutos. La absorción de un sustrato de sonda por cada transportador solo o en presencia de un inhibidor selectivo y por el control vectorial se llevará a cabo como control.

Evaluación de inhibidores: La absorción de un sustrato de sonda por cada transportador se llevará a cabo solamente o en presencia de un inhibidor selectivo o del artículo de prueba. La absorción del sustrato de sonda por el control vectorial también se realizará como control. Si se observa inhibición, se puede determinar el IC50 .

  • Sistema de prueba: Células epiteliales intestinales humanas Caco-2, cultivadas en placas Transwell en una incubadora humidificada a 37°C en 5 % de CO2  durante 21 a 24 días
  • Tampón de ensayo: HBSS con HEPES, pH 7,4 en cámaras apicales y basolaterales
  • La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se mide antes del ensayo para confirmar la formación de uniones estrechas
  • Concentraciones de compuestos de prueba: 2 para ensayos de sustrato, 2 para ensayos de inhibición
  • Los marcadores de permeabilidad radiomarcados manitol y cafeína se utilizan para verificar la formación de uniones estrechas
  • Se utilizan sustratos de sonda radiomarcados, específicos para cada transportador
  • Inhibidores selectivos de control positivo para cada transportador con controles negativos de inhibidores

La permeabilidad aparente del artículo de prueba y de los sustratos de sonda se determina tanto en la dirección apical a basolateral (A-B) como basolateral a apical (B-A) en placas transwell. Después de 30 minutos de preincubación en un tampón de ensayo en una incubadora humidificada a 37 °C en 5% de CO2, la sonda o el artículo de prueba se agrega a una cámara (donante) con un tampón vacío en la cámara opuesta (receptora). A continuación, se añaden inhibidores a ambas cámaras cuando corresponda. Las placas se incuban a 37 °C en 5% de CO2  durante 2 horas. Las muestras de la cámara donante y receptora se recolectan y analizan para detectar la presencia del artículo de prueba utilizando LC-MS. Luego se determinan la permeabilidad del artículo de prueba y la relación de eflujo.

Evaluación del sustrato: El transporte del artículo de ensayo solo o en presencia de inhibidores selectivos se determinará en ambas direcciones. El transporte de un sustrato de sonda para cada transportador solo o en presencia de inhibidores selectivos se realizará como controles.

Evaluación del inhibidor: El transporte de un sustrato de sonda se determinará en ambas direcciones después de la incubación durante 2 horas solo o en presencia de inhibidor selectivo o del artículo de prueba. Si se observa inhibición del transporte de salida, se puede determinar el IC50 .

  • Sistema de prueba: Vesículas de membrana (50 μg/pocillo) que expresan el transportador de salida (ABC) BSEP.
  • Concentraciones de compuestos de prueba: 2 para ensayos de sustrato; 2 para ensayos de inhibición.
  • Se midió la actividad dependiente del trifosfato de adenosina (ATP), con monofosfato de adenosina (AMP) utilizado como control.
  • Sustrato de sonda radiomarcado específico para BSEP
  • Inhibidores de control positivo para cada transportador

Las vesículas de membrana que expresan BSEP y el artículo de prueba o el sustrato de la sonda se incubarán en placas de 96 pocillos. La absorción se iniciará con la adición de trifosfato de adenosina (ATP), seguida de incubación durante 30 minutos a 37 °C. El monofosfato de adenosina (AMP) se utilizará en paralelo como control negativo. La absorción se terminará mediante aspiración al vacío y enjuague de los filtros dos veces con exceso de tampón de transporte frío como hielo. A continuación, se extraen las vesículas de las placas filtrantes para la cuantificación de LC-MS y el cálculo de la actividad dependiente de ATP.

Evaluación del sustrato: La absorción del artículo de prueba solo y con inhibidor selectivo en presencia de ATP se comparará con la absorción en presencia de AMP.  La absorción de un sustrato de sonda por BSEP solo y en presencia de inhibidor selectivo se realizará como controles.

Evaluación de inhibidores: La absorción de un sustrato de sonda se realizará sola y en presencia de un inhibidor selectivo o del artículo de prueba; la absorción en presencia de ATP se comparará con la absorción en presencia de AMP.  Si se observa inhibición de la absorción dependiente de ATP del artículo de prueba, se puede determinar el IC50 .

 

Entregables

Estos ensayos identificarán y perfilarán las interacciones de sustrato o inhibición con los transportadores de fármacos de membrana. Los datos describirán el grado de absorción y/o salida, la permeabilidad del artículo de prueba, la inhibición del transportador y los valores de IC50 , según corresponda.

Estos datos también se pueden utilizar para evaluar los riesgos de DDI en función de las interacciones probables con terapias concomitantes y ayudar a clasificar nuevos candidatos a fármacos. Si se observan interacciones, la farmacometría puede permitir una orientación adicional al evaluar la necesidad de un ensayo clínico.