La inducción de enzimas CYP (típicamente CYP1A2, CYP2B6 y CYP3A4) se mide in vitro después de la exposición al artículo de prueba en cultivos monocapa de hepatocitos humanos.
Los experimentos iniciales deben investigar el potencial para inducir las enzimas CYP1A2, CYP2B6 y CYP3A4. Si se observa la inducción de enzimas CYP3A4, el patrocinador también debe evaluar el potencial de inducción de las enzimas CYP2C (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19). Luego, los efectos se comparan con los provocados por inductores de control positivo de las enzimas CYP bajo investigación. Además, los hígados de animales ex vivo (generalmente ratones, ratas, perros o monos) se pueden procesar en fracciones subcelulares y usarse para evaluar los efectos mediados por artículos de prueba sobre las enzimas metabolizadoras de fármacos después de la administración in vivo durante los estudios de evaluación de seguridad.
Consideraciones regulatorias para los estudios de inducción enzimática
Estos estudios son recomendados por las pautas de interacción farmacológica (DDI) de la FDA y la EMA para evaluar la inducción del citocromo P450 para CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 y CYP3A4 antes de ir a los primeros ensayos en humanos.
Los datos de inducción se utilizan para determinar el requisito y el alcance de los estudios clínicos de DDI.
Método
- Sistema de prueba: Hepatocitos individuales de donantes humanos, criopreservados
- Enzimas CYP evaluadas: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
- Concentraciones de artículo de ensayo: Seleccionado para delimitar las exposiciones clínicas previstas (0,1 – 10X Cmáx), a menos que esté limitado por la solubilidad. Seleccione 5 concentraciones para citotoxicidad, 7 para inducción de ARNm y 3 para inducción de actividad enzimática
- Tiempo de incubación: 72 horas, con medios actualizados cada 24 horas.
Citotoxicidad
En ensayos preliminares, los hepatocitos de un donante se cultivan en presencia de un artículo de prueba (cinco concentraciones) o tamoxifeno de control positivo (50 μM) en triplicados durante 72 horas en una incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2, con intercambios de medio ± artículo de prueba o controles cada 24 horas. Después de 72 horas, la viabilidad de los hepatocitos se evaluará mediante el ensayo MTS. Los resultados se utilizarán para determinar las concentraciones de artículos de prueba no tóxicos para los ensayos de inducción.
Estabilidad
Junto con el ensayo de citotoxicidad, se recogen muestras de medio para evaluar las concentraciones del artículo de ensayo a lo largo del tiempo.
Inducción de ARNm de CYP
Los hepatocitos de tres donantes se incuban en presencia o ausencia de artículo de ensayo (siete concentraciones) o inductores de control (ver más abajo) en pocillos por triplicado durante 72 horas en una incubadora humidificada a 37 °C en CO2 al 5%, con intercambio de medio ± artículo de ensayo o controles cada 24 horas. Después de 72 horas, se extrae el ARNm y se determina la expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de cada ARNm de CYP se normaliza al de un gen de control endógeno (por ejemplo, GAPDH). La inducción de la expresión del gen CYP en pliegues se calcula utilizando el método 2-ΔΔCT. Los aumentos dependientes del compuesto de prueba en los niveles de ARNm de CYP ≥2 veces en relación con el control del vehículo, o una respuesta ≥20% de la respuesta de los controles positivos, pueden interpretarse como resultados positivos.
Inducción de la enzima CYP
Los hepatocitos de tres donantes se cultivan en presencia o ausencia de compuesto de prueba (tres concentraciones) o inductores de control (como se indicó anteriormente) en triplicado en pocillos durante 72 horas en una incubadora humidificada a 37°C en 5% de CO2, con intercambios de medio ± compuesto de prueba o controles cada 24 horas. Después de 72 horas, los hepatocitos se incuban en un medio fresco que contiene sustratos de CYP apropiados (ver más abajo) durante 2 horas, después de lo cual se terminan las reacciones y se recolectan muestras para el análisis de metabolitos (ver más abajo) utilizando un método analítico de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Los aumentos dependientes del artículo de prueba en la actividad de la enzima CYP ≥2 veces en relación con el control del vehículo, o una respuesta ≥20% de la respuesta de los controles positivos, pueden interpretarse como resultados positivos.
