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Unión a proteínas

Después de la entrada y aparición de un fármaco en la circulación sistémica, solo la fracción libre y no unida es capaz de tener un efecto farmacológico (o toxicológico). El grado de unión a proteínas plasmáticas se puede determinar in vitro o ex vivo mediante diálisis de equilibrio, ultrafiltración o ultracentrifugación.

  • Cumplimiento normativo

  • Diversos métodos

  • Análisis de eficacia y seguridad

La partición de un artículo de prueba en eritrocitos frente a plasma se puede determinar in vitro o ex vivo en sangre animal y humana. La unión microsomal a proteínas se puede evaluar mediante diálisis de equilibrio. Se requieren datos que describan cómo el fármaco se une a las proteínas plasmáticas y cómo funciona la partición sangre-plasma para ayudar en la evaluación de los datos farmacológicos, farmacocinéticos y toxicológicos. (Ver también SEND 3.1)

Consideraciones regulatorias para la unión de proteínas plasmáticas, la partición de sangre a plasma y los estudios de unión a proteínas microsomales

La investigación de la fracción no unida a proteínas plasmáticas o microsomales de un artículo de prueba es fundamental para caracterizar el perfil farmacocinético in vivo de dosis, exposición, eficacia y márgenes de seguridad en farmacología clínica. La evaluación entre especies de la unión a proteínas plasmáticas es un requisito de IND y se detalla en la guía ICH M3 (R2).

Métodos

  • Sistema de prueba: Plasma combinado de cada especie o soluciones específicas de proteínas plasmáticas (p. ej., albúmina sérica humana, glicoproteína ácida α1, gammaglobulina)
  • Las concentraciones se seleccionan para agrupar las exposiciones clínicas conocidas (0,1 – 10X Cmáx.), a menos que estén limitadas por la solubilidad.
  • Diálisis de equilibrio
  • La diálisis de equilibrio se realiza utilizando un aparato de diálisis de alto rendimiento (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Se agrega una matriz fortificada (plasma o proteína plasmática aislada) a la cámara donante, mientras que la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) se agrega a la cámara receptora de cada pocillo. Luego, las placas se sellan con una membrana permeable al gas y se incuban a 37 °C en 5% de CO2 durante el tiempo designado (ver más abajo).  Después de la incubación, las muestras de cada cámara se analizan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).
  • Estabilidad en matriz: El artículo de prueba se incuba en plasma y en DPBS a una concentración única de hasta cinco puntos de tiempo.
  • Tiempo de equilibrio: El artículo de prueba se agrega al plasma en una sola concentración y se dializa contra DPBS durante un máximo de cinco puntos de tiempo.
  • Dependencia de la concentración de unión a proteínas: El artículo de prueba se agrega al plasma a tres concentraciones y se dializa contra DPBS durante el tiempo requerido para el equilibrio. 
  • Un control positivo como la warfarina se prueba en diálisis de equilibrio paralelo durante ≥5 horas.
  • Ultrafiltración
  • Se agregará plasma fortificado a la porción del depósito de muestra de un dispositivo de ultrafiltración con un límite de peso molecular de 30,000 Da. Las muestras se centrifugarán a 37°C y 2.000 × g durante 15 minutos (u otras condiciones apropiadas). Después de la centrifugación, el ultrafiltrado será analizado por LC-MS para determinar el compuesto de prueba y su contenido en comparación con las concentraciones iniciales. Todas las determinaciones de unión a proteínas se realizarán por triplicado. 
  • Unión inespecífica: El artículo de prueba se agrega al ultrafiltrado de plasma de control (PUF) a dos concentraciones y se centrifuga de acuerdo con el procedimiento de ultrafiltración. El dializado se analizará para determinar la recuperación del artículo de prueba y la posible unión no específica en ausencia de plasma.
  • Dependencia de la concentración de unión a proteínas: El artículo de prueba se agrega al plasma a cinco concentraciones y se centrifuga de acuerdo con el procedimiento de ultrafiltración. El ultrafiltrado se analizará en busca del artículo de prueba.
  • Ultracentrifugación
  • Se añadirá plasma fortificado a los tubos de ultracentrífuga y se centrifugará a 37ºC a 223.000 × g durante 4 horas (u otras condiciones apropiadas) para lograr la separación del ultracentrifugado plasmático de la proteína plasmática. Después de la centrifugación, el ultracentrifugado se analizará mediante LC-MS y se comparará con las concentraciones iniciales. 
  • Enlace inespecífico: El artículo de prueba se agrega al plasma humano de control y al ultrafiltrado de plasma (PUF) a dos concentraciones y se incuba en tubos de ultracentrífuga durante 4 horas. La matriz se analizará para determinar la recuperación del artículo de prueba y la posible unión no específica en ausencia de plasma.
  • Dependencia de la concentración de unión a proteínas: El artículo de prueba se agrega al plasma a cinco concentraciones y se centrifuga de acuerdo con el procedimiento de ultracentrifugación. El ultracentrifugado se analizará para el artículo de prueba.

  • Los estudios BPP se utilizan para determinar la partición in vitro de sangre a plasma de un compuesto de prueba en sangre de varias especies, incluyendo el humano.
  • Sistema de prueba: La sangre obtenida de cada especie animal puede combinarse de al menos tres donantes. No se agrupará sangre humana obtenida de al menos tres voluntarios.
  • Los valores de hematocrito se determinan para las muestras de sangre animal combinadas y las muestras individuales de sangre humana.
  • La sangre se almacena a 2-8°C y se usa lo antes posible dentro de una semana tras la recepción. 
  • Se agrega el artículo de prueba a la sangre y se toman las alícuotas iniciales. La sangre fortificada se incuba a 37°C como se indica. Después de la incubación, se retiran las alícuotas para su análisis. La sangre restante se centrifuga para obtener plasma; las alícuotas se recopilan para su análisis y se comparan con las alícuotas iniciales.
  • Estabilidad en matriz: El artículo de prueba se incuba en sangre a una sola concentración durante un máximo de cuatro puntos de tiempo.
  • Tiempo de equilibrio: El artículo de prueba se agrega a la sangre en una sola concentración durante un máximo de cuatro puntos de tiempo.
  • Dependencia de la concentración de unión a proteínas: El artículo de prueba se agrega a la sangre en hasta 5 concentraciones y se incuba hasta el punto de equilibrio.
  • Para los artículos de prueba radiomarcados, las alícuotas de sangre se solubilizan antes del recuento de centelleo líquido (LSC). Para los artículos de prueba no radiomarcados, las alícuotas de sangre se lisan antes de la extracción y el análisis mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).

  • Una evaluación del potencial de un artículo de prueba para unirse a la proteína microsomal del hígado humano in vitro permite la corrección de la fracción no unida en ensayos que utilizan estos sistemas.
  • La diálisis de equilibrio se realiza por triplicado utilizando un aparato de diálisis de alto rendimiento (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Se agregan microsomas fortificados a la cámara donante mientras se agrega un tampón de ensayo a la cámara receptora de cada pocillo. A continuación, las placas se sellan con una membrana permeable al gas y se incuban a 37 °C en 5% de CO2  durante 5 horas. Después de la incubación, las muestras de cada cámara se analizan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).
  • Unión a proteínas: Los microsomas hepáticos humanos se diluyen a tres concentraciones (0.05, 0.1, 0.5 mg/ml) en tampón fosfato. Luego, el artículo de prueba se agrega a los microsomas en tres concentraciones para un total de 9 muestras. Las muestras de matriz fortificada se transfieren a cámaras donantes de HTD por triplicado y se dializan contra fosfato durante 5 horas.
  • Estabilidad en microsomas: Las muestras de matriz fortificada de arriba se incuban a 37 °C en 5% de CO2  durante 0 y 5 horas.

 

Entregas

Los ensayos de unión a proteínas plasmáticas identificarán el alcance de la unión del artículo de prueba, proporcionando un porcentaje unido y no unido, el tiempo hasta el equilibrio de diálisis y el perfil de dependencia de la concentración en humanos y otras especies preclínicas seleccionadas. La partición de sangre a plasma proporcionará un coeficiente de partición. Estos datos se pueden utilizar para calcular la fracción libre en plasma para permitir la corrección de las exposiciones in vivo para perfilar la eficacia y los márgenes de seguridad.  

Los ensayos de unión a proteínas microsomales identificarán el alcance de la unión del artículo de prueba a las proteínas microsomales del hígado humano para la corrección de IC50 u otros parámetros para tener en cuenta la fracción de fármaco libre.