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Inhibición enzimática

La inhibición del citocromo P450 (CYP) y las enzimas UGT es una de las principales causas de interacciones farmacológicas clínicamente relevantes. El potencial inhibitorio de un artículo de prueba se evalúa determinando su efecto sobre el metabolismo de sustratos de sonda selectivos para enzimas CYP humanas en incubaciones combinadas basadas en microsomas hepáticos humanos. La cinética de inhibición enzimática se puede caracterizar aún más y los datos resultantes se pueden utilizar para predecir si puede ocurrir una interacción farmacológica clínicamente significativa después de la administración del medicamento.

  • Estudios recomendados por la FDA y la EMA

  • Ensayos de citotoxicidad y estabilidad

  • ARNm de CYP e inducción enzimática

Consideraciones regulatorias para los estudios de inhibición enzimática

Estas guías de interacciones farmacológicas (DDI) de la FDA y la EMA recomiendan estudios para generar datos sobre la inhibición del citocromo P450 reversible (directa) e irreversible (dependiente del tiempo) antes de pasar a los primeros ensayos en humanos. Los datos de inhibición se utilizan para determinar el requisito y el alcance de los estudios clínicos de DDI.

Método

  • Sistema de prueba: Microsomas hepáticos humanos agrupados (HLM)
  • Enzimas CYP evaluadas: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 y CYP3A4/5
  • Enzimas UGT evaluadas en ensayos de inhibición directa bajo pedido: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15 
  • Concentraciones de artículo de ensayo: 8 concentraciones por triplicado
  • Todas las preparaciones e incubaciones de muestras se realizan utilizando un sistema automatizado de manipulación de líquidos Star de Hamilton Microlab

 

La inhibición de CYP se mide tanto en ensayos directos como dependientes. Se utiliza un sustrato selectivo de CYP, a una concentración de sustrato que alcanza la mitad de la velocidad máxima de reacción (Km) para cada enzima CYP (ver más abajo). Los inhibidores conocidos se utilizan como controles positivos para ensayos de inhibición directa y dependiente del metabolismo. Todas las incubaciones terminan con la adición de acetonitrilo refrigerado, que contiene un patrón de metabolito interno marcado de forma estable específico para el sustrato de CYP.

Inhibición dependiente del tiempo (irreversible)

Los ensayos que utilizan 8 concentraciones de artículo de prueba se incuban en ausencia y presencia de NADPH durante 30 minutos antes de la dilución en una mezcla de ensayo de sustrato de sonda. Si se observa una inhibición notable dependiente del tiempo, se pueden determinar parámetros cinéticos adicionales, incluida la constante de inactivación (kinact) y la constante de inhibición (KI). Estos parámetros, determinados experimentalmente variando el tiempo de preincubación y la concentración de inhibidor, pueden ayudar a definir el potencial de interacciones fármaco-fármaco. 

Inhibición directa

Los ensayos se realizan en ausencia y presencia de 8 concentraciones de artículo de prueba para determinar el potencial de inhibición y definir un IC50 cuando sea posible.

La inhibición directa se puede caracterizar aún más determinando la constante de inhibición (Ki) y el tipo de inhibición observada, utilizando 5 concentraciones de sustrato de sonda.

Citocromo P450SustratoAnalitoInhibición directaInhibición dependiente del tiempo
CYP1A2FenacetinaAcetaminofénFluvoxaminaFurafyllina
CYP2B6BupropiónHidroxibupropiónOrfenadrinaTiotepa
CYP2C8AmodiaquinaDesetilamodiaquinaMontelukastGemfibrozilo 1-O-β-glucurónido
CYP2C9Diclofenaco4'-HidroxidiclofenacoSulfafenazolÁcido tienílico
CYP2C19Mephenitoína4'-HidroximefenitoínaNootkatoneEsomeprazol
CYP2D6DextrometorfanoDextrorfanoQuinidinaParoxetina
CYP3A4/5Testosterona6β-hidroxitestosteronaKetoconazolEritromicina
CYP3A4/5Midazolam1'-hidroximidazolamKetoconazolTroleandomicina

 

Entregas

Estos ensayos proporcionarán valores de IC50 para la inhibición directa o irreversible de las enzimas CYP. Si se observa una inhibición directa significativa, se puede determinar la constante de inhibición (Ki). Si se observa una inhibición significativa dependiente del tiempo, se pueden determinar los parámetros de inactivación basados en mecanismo (KI  y kinact). Con estos parámetros, la farmacometría puede permitir una orientación adicional al evaluar la necesidad de un ensayo clínico.